1512 zog sich Lucrezia, 32-jährig aus dem öffentlichen Leben zurück. Es wird vermutet, dass dies mit der Nachricht über das Ableben ihres ersten Sohnes Rodrigo, sein Vater war der geliebte dritte Ehemann Alfonso von Aragon, in Verbindung steht. Lucrezia verbrachte immer mehr Zeit ihn ihren Apartments oder in nahegelegenen Klöstern, zudem widmete sie sich verstärkt der Religion, was bei dem Familienhintergrund nicht verwunderlich ist.

Die letzte Schwangerschaft Lucrezias zerrte ihre ganzen Kräfte auf, war sie doch bereits im Herbst 1518 schwer erkrankt. Die Geburt ihrer Tochter Isabella Maria schwächte sie vollends, sodass sie in der Nacht zum 24. Juni 1519 im Alter von 39 Jahren in den Armen ihres Ehemannes Alfonso I. d´Este verstarb. Ihre jüngste Tochter Isabella Maria, ihr neuntes Kind, folgte ihrer Mutter nur wenige Stunden später. Die letzten Worte von Lucrezia Borgia, Fürstin von Ferrara, sollen folgende gewesen sein: „Ich gehöre Gott, für immer.“