Ihre dritte arrangierte Ehe mit dem 17-jährigen Alfonso von Aragon, Herzog von Bisceglie und ein Neffe des Königs Federigo (1452 – 1504) von Neapel aus dem Haus Trastámara, war zunächst auch eine reine Zweckehe, aus ihr entwickelte sich aber eine Liebesehe, wie die Quellen berichten. Am 1. November 1499 gebar Lucrezia ihren ersten Sohn, Rodrigo (1499 – 1512), dem späteren Herzog von Bisceglie. Aus politischen Gründen geriet Alfonso zwischen die Fronten, denn ihr Vater, der Papst, und ihr Bruder Cesare gingen eine Allianz mit den Franzosen ein, die im Konflikt mit Spanien und Neapel standen.

Da Alfonso aus einem spanischen Adelsgeschlecht kam, kam es zu schweren Auseinandersetzungen, die in einem Überfall am 15. Juli 1500 gipfelten, bei dem Alfonso schwer verletzt wurde. Lucrezia und seine Schwester Sancia kümmerten sich um seine Pflege und als er wieder genesen war, vollzog er einen Racheakt an seinem Schwager Cesare Borgia. Er schoss mit Pfeil und Bogen auf ihn, jedoch erfolglos. Cesare ließ ihn dann von dem Mörder Michelotto erwürgen, laut diesem soll auch der Papst Alexander VI. seine Finger mit im Spiel gehabt haben. So wurde ihr geliebter Gatte am 18. August 1500 im Auftrag von ihrem Bruder Cesare Borgia ermordet.