Mit 21 Jahren wurde die verwitwete Lucrezia Borgia von ihrem Vater Papst Alexander VI. am 30. Dezember 1501 zum 4. Mal verheiratet, diesmal mit Alfonso I. d’Este (1476 – 1534) von Ferrara, welcher vier Jahre älter war als sie. Alfonso I. wurde 1505 nach dem Verscheiden seines Vaters Ercole I. zum Herzog von Ferrara, Modena und Reggio ernannt. Während ihrer Ehe baute Lucrezia den Hof von Ferrara zu einem Kulturzentrum um. Sie knüpfte Kontakte zu vielen Gelehrten, Künstlern, Poeten, Höflingen und Bürgern ihrer Zeit und holte sie auch nach und nach an ihren Hof.

So versammelte sie in Ferrara die gelehrtesten und berühmtesten Köpfe ihrer Zeit, der Renaissance. Darunter waren unter anderem der Dichter Ludovico Ariosto ( 1474 – 1533), welcher mit „Orlando Furioso“ das größte Epos der Renaissance schrieb, der Schriftsteller Pietro Bembo (1470 – 1547), der Humanist und Dichter Filippo Strozzi (1488 – 1538) und der Humanist Gian Giorgio Trissino (1478 – 1550). Die Bewohner von Ferrara feierten sie als geistreiche, aktive und attraktive Frau, die die Stadt zu einem Künstlerort gemacht hatte.

Als im Jahr 1503 ihr Vater Papst Alexander der VI. verstarb, kehrte eine bisher in ihrem Leben nicht gekannte Beständigkeit bei ihr ein. Nur zwei Jahre später folgte auch ihr Schwiegervater Ercole ihrem Vater in das Grab nach und so wurden sie und Alfonso zu Herzogin und Herzog von Ferrara ernannt.

Zusammen mit ihrem vierten Ehemann hatte Lucrezia mehrere Kinder. Am 5. September 1502 wurde ihre erste Tochter totgeboren, drei Jahre später 1505 kam Alessandro zur Welt, der aber noch im selben Jahr verstarb. Ein längeres Leben war ihren beiden nachfolgenden Söhnen vergönnt. Ercole II. d´Este wurde am 4. April 1508 geboren. Er heiratete 1528 Renée de France (1510 – 1575), die eine Tochter des französischen Königs Ludwig XII. war. Nach dem Tod seines Vaters wurde Ercole II. 1534 zum Herzog ernannt, er verstarb im Jahr 1559.

Am 25. August 1509 erblickte Ippolito II. d´Este das Licht der Welt. Er wurde ein geachteter Kirchenmann. Er wurde 1538/39 zum Kardinal berufen und wurde auch mehrmals ein Kandidat bei den Papstwahlen, jedoch gelang es ihm nie, dieses Amt auszuführen. Er starb 1572. Es folgte Alessandro d´Este, welcher im April 1514 geboren wurde, aber bereits am 10. Juli 1516 starb und Eleonora d´Este (1515 – 1575), welche später Nonne wurde. Francesco d´Este wurde am 1. November 1516 geboren und wurde später Fürst von Massa. Er ehelichte 1540 Maria di Cardona aus dem Haus Folch de Cardona, auch eine politische Ehe wie die seiner Mutter und er starb am 22. Februar 1578.